产品介绍

Mito-Tracker Deep Red FM (线粒体深红荧光探针)，是一种具有细胞通透性、能够特异性地标记细胞中具有生物活性的线粒体， 并检测线粒体膜电位的线粒体深红荧光探针。本产品为高纯度探针，可以兼容后续的细胞固定和通透，但染色后再固定和通透，荧光强度会有一定的下降。

本产品是一种深红荧光染料，只需简单地和细胞孵育，即可通过被动运输穿过细胞膜，并借助本探针含有的弱巯基反应性的氯甲 基(mildly thiol-reactive chloromethyl)官能团特异性地标记有生物活性的线粒体。本探针含有的弱巯基反应性的氯甲基， 可以 和线粒体内蛋白的巯基反应并共价连接，因此后续实验使用多聚甲醛或甲醛等醛类固定剂，以及细胞通透的去垢剂Triton X-100 等处理时，线粒体的荧光标记不会消失，但可能会有一定程度的下降(约下降2-8倍)。由于本荧光探针的激发光谱和发射光谱与常 见的绿色和红色荧光探针通常不会重叠，因此非常适合用于多重荧光染色实验。

Mito-Tracker Deep Red FM分子式为C34H36Cl2N2， 分子量为543.58， Mito-Tracker Deep Red FM为深红荧光探针，最大激发 波长为644nm，最大发射波长为665nm。Mito-Tracker Deep Red FM的化学结构式以及激发光谱和发射光谱参考图1。

图1. Mito-Tracker Deep Red FM的化学结构式(A)及激发光谱和发射光谱(B)。

Mito-Tracker Deep Red FM可以用作线粒体特异性的荧光探针。和Rhodamine 123或JC-1相似，Mito-Tracker Deep Red FM 对于线粒体的染色依赖于线粒体膜电位， 因此该探针只能对活的细胞或组织进行染色，不能对固定或通透后的细胞或组织进行染 色。使用Mito-Tracker Deep Red FM染色细胞线粒体效果参考图2。

图2. Mito-Tracker Deep Red FM (线粒体深红荧光探针)对于NRK-52E细胞(大鼠肾小管上皮细胞)的染色效果。Mito-Tracker Deep Red FM染色的NRK-52E细胞其线粒体呈现洋红色荧光(图B。注：为了区分Cy3、PE等普通红色荧光，深红荧光处理成洋红 色伪彩)，Actin-Tracker Green-488 (C2201S)染色的NRK-52E细胞其微丝呈现绿色荧光(图C)， 洋红色荧光、绿色荧光及细胞核 蓝色荧光的叠加(merge)效果见图D。其中细胞核使用Hoechst 33342 (KC1027)染色。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同 而存在差异，图中数据仅供参考。注： Mito-Tracker Deep Red FM染色活细胞线粒体后经固定、通透处理，再进行Actin-Tracker Green-488染色和Hoechst 33342染核。

 由于Mito-Tracker Deep Red FM在线粒体内的聚集依赖于线粒体的膜电位，因此本产品也可以作为线粒体膜电位的指示探针， 并可以通过检测线粒体膜电位的变化来检测细胞凋亡。

按最终工作浓度为50-200nM计算，本产品每50µg可以配制约460-1800ml Mito-Tracker Deep Red FM工作液。 包装清单：

注意事项

1.Mito-Tracker Deep Red FM可以用于活细胞的线粒体荧光染色， 不适合用于固定后细胞或者组织的染色；但在用本产品标记线 粒体后，后续可以进行固定和通透，并用其它探针进行染色或进行免疫荧光染色，但染色后再固定和通透，荧光强度会有一定程 度的下降。而且不同的细胞， 固定和通透的影响会有所区别，建议对固定和通透试剂、条件进行一定的测试。

2.本产品仅包含非常微量的粉末，使用前请先离心数秒钟， 使微量粉末充分沉降到管底。

3.荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

4.本产品对人体有害， 操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

5.本产品仅限于专业人员的科学研究用， 不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

1. Mito-Tracker Deep Red FM储存液的配制：

取一管50μg Mito-Tracker Deep Red FM粉末加入460μl的无水DMSO (anhydrous dimethylsulfoxide)，充分溶解后，得到浓 度为200μM的Mito-Tracker Deep Red FM储存液。也可以根据需要配制成其它浓度的储存液，如1mM。适当分装后避光保存于

-20ºC或更低温度。

2. Mito-Tracker Deep Red FM工作液的配制：

a.取少量200μM Mito-TrackerDeep Red FM储存液按照1:1000-1:10,000的比例加入到细胞培养液或适当的溶液(例如含钙镁 离子的HBSS)中，使最终浓度为20nM-200nM。例如取1µl 200μM的Mito-Tracker Deep Red FM储存液加入到1ml细胞培养 液或适当的溶液(例如含钙镁离子的HBSS)中， 混匀后即为200nM的Mito-Tracker Deep Red FM工作液。如果染色的细胞后 续需要进行固定或通透等步骤，建议工作浓度为50nM-500nM。Hanks' Balanced Salt Solution (with Ca2+& Mg2+) (C0219) 可以向聚顶生物订购。

b.Mito-Tracker Deep Red FM工作液使用前需37ºC预温育。

注：Mito-Tracker Deep Red FM工作液的浓度可以根据实际情况进行适当调整。为降低非特异性荧光染色和线粒体毒性，在 染色效果可以接受的范围内， 建议尽量使用较低浓度的Mito-Tracker Deep Red FM。

3. 贴壁细胞的线粒体染色：

a.当细胞在细胞培养板或培养皿中培养至一定密度时， 去除细胞培养液，加入步骤2中配制好的Mito-Tracker Deep Red FM工 作液， 37ºC孵育15-30分钟。注：最佳孵育时间需根据细胞类型进行适当的优化。

b.去除Mito-Tracker Deep Red FM工作液，加入37ºC预温育的新鲜细胞培养液。

c.用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或荧光酶标仪进行观察或检测。此时可观察到线粒体呈明亮的强荧光染色。如果染色效果欠 佳，可以提高Mito-Tracker Deep Red FM工作液浓度或在推荐的时间范围内适当延长染色时间。

注：标记的Mito-Tracker Deep Red FM易淬灭，请注意尽快进行拍照等荧光检测。也可以通过降低荧光显微镜的激发光强度 (即汞灯或LED光源)或适当降低Mito-Tracker Deep Red FM工作液浓度以延缓淬灭。

4. 悬浮细胞的线粒体染色：

a.1000×g离心5分钟，弃上清，用37ºC预热的Mito-Tracker Deep Red FM工作液轻轻重悬细胞，37ºC孵育15-30分钟。注：最 佳孵育时间需根据细胞类型进行适当的优化。

b.孵育结束后， 1000×g离心5分钟，弃上清，加入37ºC预温育的新鲜细胞培养液重悬细胞。

c.用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪进行观察、分析或检测。

注：如果需要在载玻片或盖玻片上固定悬浮细胞，可先用聚顶生物的Poly-D-lysine/多聚赖氨酸(ST508)处理载玻片或盖玻片。

5. 染色后的细胞固定或细胞通透(选做)：

用本试剂染色线粒体后， 可进行固定和通透，并用其它探针进行复染或进行其它的免疫荧光染色。

a.细胞固定：在染色后，用37ºC温育的新鲜细胞培养液或HBSS洗涤细胞，小心吸除洗涤用的培养液，加入4%多聚甲醛固定液(例 如P0099)或含3.7%新鲜甲醛的完全培养液，室温固定15-30分钟。固定完成后用HBSS洗涤2-3次。

注：采用37ºC预热的固定液并在37ºC固定约15min，可更好地维持细胞形态。对于内皮细胞，在本染料染色之后再用含3.7% 甲醛的完全培养液于37ºC孵育15分钟有良好的固定效果。

b.细胞通透：将固定后的细胞加入聚顶生物生产的免疫染色通透液(Triton X-100)(P0096)、免疫染色强力通透液(P0095)或含约 0.2% Triton X-100的PBS，室温孵育10-15分钟。然后用PBS洗涤。使用本探针染色活细胞后， 再固定和通透的细胞内荧光效 果参考图3。

注1：对于内皮细胞，在本染料染色之后再用含约0.2% Triton X-100的PBS室温孵育10分钟有良好的通透效果。

注2：也可用丙酮冰浴通透5分钟，然后用PBS洗涤。即使后续无需抗体标记，丙酮通透处理对降低背景信号也会有一定的帮助。

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