产品介绍

B27 是一种优化的无血清添加剂，本产品在此基础上，从标准配方中去除了胰岛素 。该添加剂以 50X 工作浓度的液体形式提供，可用于支持胚胎、产后和成体的海马神经元及其他中枢神经系统（CNS）神经元的生长和活性维持，无需使用星形胶质细胞饲养层 。

应用范围

   1 神经元培养

• 产前和胚胎神经元：在神经元基础培养基中使用本添加剂，可获得优化的活性和长期的存活率。

• 神经来源的肿瘤细胞系：在神经元基础培养基中添加，能有效保证其活性。

• 产后和成年大脑神经元：用于 Neurobasal™ - A 培养基的补充，可维持其最佳活力和长期生存。

   2 干细胞研究

    在 DMEM / F12 培养基中添加，已被证明可支持扩增来自小鼠胚胎纹状体和中脑的 EGF 响应性的前体细胞。还可用于研究多能干细胞向心肌细胞的分化 。

   3 其他研究

    适用于神经发育、神经分化、糖尿病神经病变等相关研究领域 。

使用方法

   1 完全培养基制备

1. 提前将本产品置于 4℃解冻过夜。

2. 在使用前，无菌操作添加 2% 本产品（即每 1L 培养基中加入 20ml 本添加剂）和 0.5mM L - 谷氨酰胺（2.5ml/L）至神经元基础培养基中，配制成神经元完全培养基。例如，若要配制 500ml 神经元完全培养基，则需加入 10ml 本添加剂和 1.25ml L - 谷氨酰胺（假设 L - 谷氨酰胺储存液浓度为 200mM） 。

3. 对于原代大鼠海马神经元培养，在上述制备的神经元完全培养基中，还需要额外补充 25μM L - 谷氨酸，且在培养的前四天需维持此补充状态，从第四天开始的换液中不再添加 L - 谷氨酸 。

4. 配置好的完全培养基，在 2 - 8℃避光条件下，可稳定保存一周 。

   2 细胞培养步骤

1. 培养表面处理：用无菌的 0.05mg/ml 冷的多聚 - D - 赖氨酸水溶液包被培养表面（如德国玻璃或细胞培养级塑料），按每平方厘米表面 0.15ml 的量加入，在室温下孵育 1 小时。之后去除多聚 - D - 赖氨酸溶液，并用无菌蒸馏水冲洗两次（务必冲洗彻底，因为多聚 - D - 赖氨酸对细胞有毒性）。将培养板在细胞培养 hood 中敞开放置，直至孔内完全干燥。干燥后的培养板可立即使用，或在 4℃条件下最多保存 2 周 。

2. 细胞接种：根据标准实验室程序或细胞自带说明书分离原代大鼠神经元，或解冻冻存的原代大鼠神经元。在预热至 37℃的神经元完全培养基（按上述方法制备）中接种细胞，建议细胞密度为 160 个细胞 /mm²，也可根据实验需求自行优化细胞密度。对于海马神经元，需注意在接种时培养基中须添加 25μM L - 谷氨酸 。

3. 细胞培养条件：将接种好细胞的培养板置于 36 - 38℃、含 5% 二氧化碳的潮湿环境中培养（使用自然空气亦可，但推荐 9% 氧气和 5% 二氧化碳的气体环境）。培养 4 - 24 小时后，更换一半体积的新鲜培养基，之后继续在培养箱中培养 。

4. 换液操作：对于海马神经元以外的细胞，在接种 4 天后，更换一半体积的新鲜完全培养基，之后每三天重复一次此操作。对于海马神经元，接种三天后，用不含 L - 谷氨酸的新鲜完全培养基更换一半体积的培养基，之后每三天重复一次。另外，在完全培养基中添加 25µM 2 - 巯基乙醇，可改善海马神经元的长期存活率 。

   3 分离原代大鼠胚胎神经元（推荐用于受精 18 天的大鼠胚胎海马神经元和大脑皮层神经元培养）

1. 从受精 18 天的大鼠胚胎中分离出大脑皮层和双侧海马。

2. 将分离出的所有组织收集到预置了 Hibernate - E 完全培养基的锥形管中，放置一段时间，直至所有组织解体。

3. 使组织沉积在管底，然后小心去除上清液，仅留下刚好能覆盖组织的最少量培养基。

4. 在不含钙离子的 Hibernate - E 培养基中，使用 2mg/ml 过滤灭菌的木瓜蛋白酶溶液，在 30℃条件下酶解组织约 30 分钟，期间每 5 分钟轻轻摇晃锥形管以促进降解。每对海马组织使用 2ml 酶溶液 。

5. 加入两倍体积的 Hibernate - E 完全培养基，恢复二价阳离子浓度，从而停止酶解反应。

6. 让未解离的组织沉降至管底（约 2 分钟），然后将上清液转移到 15ml 离心管中，以 150×g 离心 5 分钟 。

7. 在 1ml 神经元完全培养基中重悬沉淀物，取一小份（如 10μl）进行细胞计数，后续操作按照 “复苏和培养冻存的神经元” 的相关步骤进行 。

   4 复苏和培养冻存的神经元

1. 在解冻细胞前，用神经元完全培养基冲洗无菌的 15ml 锥形管，然后在超净工作台中通风晾干。

2. 从液氮中取出冻存管时，可稍微拧松管帽释放压力，随后再拧紧。

3. 将冻存管置于 37℃水浴中轻柔搅拌，快速解冻细胞（时间应小于 2 分钟）。当观察到冻存管中只有极少量冰晶存在（此时触摸冻存管仍感觉较冷）时，从水浴中取出 。

4. 在超净工作台中，用 70% 的异丙醇对冻存管进行消毒。在工作台台面上轻敲冻存管，使管内液体沉降到管底 。

5. 使用事先用神经元完全培养基冲洗并干燥过的 1ml 吸头，极其轻柔地将细胞转移到事先冲洗并干燥的 15ml 锥形管中 。

6. 用 1ml 预热的神经元完全培养基冲洗冻存管，以每秒一滴的速度极其缓慢地加入到 15ml 锥形管中的细胞里，每加一滴都轻柔转动锥形管一次，切勿一次性将全部培养基加入 。

7. 缓慢逐滴加入另外 2ml 预热的完全培养基，使管内液体体积达到 4ml。用 1ml 吸头轻柔混合液体，注意避免产生气泡 。

注意事项

1. 本产品经过严格除菌过滤，为无菌产品，使用过程必须在超净台内进行，防止微生物污染 。

2. 产品应尽量避免光照。充分融解并混匀后，如有需要，可适当分装后于 - 20℃避光保存。若短期内频繁使用，可 4℃避光保存，并建议在 1 - 2 周内用完 。

3. 长时间存放后，产品可能会出现少量沉淀，此时可上下颠倒混匀，待沉淀完全溶解后即可正常使用 。

4. 本产品仅限于专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品领域，也不得存放于普通住宅内 。

5. 操作过程中，请穿着实验服并佩戴一次性手套，以保障安全和健康 。