产品介绍

产品描述

Anti-GFP Nanobody Magnetic Beads （以下称 anti-GFP beads ）是将抗GFP的 纳米抗体共价偶联到磁性琼脂糖珠上，用于抓取哺乳动物、植物、细菌、酵母、昆虫等多种生物的细胞提取物中的含GFP 标签的蛋白及与其紧密相互作用的蛋白

产品属性

珠子直径：~30-100 μm（4%交联磁性琼脂糖微球）

储存液：1xPBS，含20% 乙醇和0.03% NaN₃结合能力：每20 μL Anti-GFP Beads（悬浮液）结合15-20 μg 含GFP标签的融合蛋白

配体：抗GFP纳米抗体

结合时间：只需要与细胞裂解液孵育结合1 h 左右

反应性：与GFP、YFP和CFP等融合蛋白及与其紧密相互作用的蛋白结合

产品应用
      

 可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、

酶活性测定、质谱分析（MS）等；

产品特性

保存条件： 可在 4℃保存 1 年，避免干燥和反复冻融，冰袋运输。

实验原理

 

操作说明：

收集细胞：

每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞（约一个 10 厘米培养皿） 表达 GFP 的融合蛋白。吸出生长培养基、 向培养皿中加入 2 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心管，500 g 离心 3-5 分钟并丢弃上清液。

细胞裂解：

1．用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液重悬细胞，在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。对于膜蛋白或核/染色质蛋白，可使用 RIPA 裂解液，或普通 IP 裂解液结合超声破碎细胞的方法。

2．把离心管放置在冰上 30 分钟， 可以每 10 分钟充分吹打一次，或者在 4 度旋转混合仪上裂解。

3．细胞裂解产物在 4℃ , 20,000 g 条件下离心 15 分钟，转移裂解产物到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。

注意：此时细胞裂 解产物可以放在-80℃进行长期储存。

平衡珠子：

4．振荡混匀GFP Nanobody Magnetic Beads，吸取 20μl slurry 到 500 μl 预冷的裂解缓冲液中， 在磁力架上吸附分离，丢弃上清液。 （此步骤可选，并建议吸取 20μl 珠子悬液 时剪掉枪头的前端）

结合蛋白:

5. 将细胞裂解产物加入到平衡的 珠子中（如果未做第 4 步，可在细胞裂解产物中直接加入 20μl 珠子悬液），在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 1 h，也可以根据需要延长结合时间。如果需要，保存 50 μl 的裂解 产物作为 input 进行免疫印迹分析。

6. 在磁力架上吸附分离，丢弃上清液。

清洗珠子：

7. 用 1.0 mL 预冷的裂解缓冲液中洗涤珠子，在 4 ℃旋转混合洗涤 5 min，在磁力架上吸附分离，丢弃上清液并重复洗涤 2 次。（可选：在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM）。

洗脱蛋白：

方法一：

8. 加入 40μl 2X SDS-sample buffer 重悬珠子。在 95℃条件下加热 10 min，把免疫沉淀复合物从珠子上游离出来，然后在 4 ℃, 2,500 g 条件下离心 3 分钟收集上清， 进行免疫印迹分析。

方法二

9. 加入 50μl 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，  随后 离心，转移上清液到新管中， 为了中和酸性的甘氨酸， 需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。

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