产品介绍

TRzol LS试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿替代物/氯仿后离心，样品分成水样层、中间层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来回收。

无论是人、动物、植物还是细菌，该方法对少量及大量的组织和细胞均有较好的分离效果。TRzol LS 试剂操作上的简单性允许同时处理多个样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRzol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染，可用于RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+筛选、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR ，当两条引物位于单一外显子内时，建议用扩增级的DNase I来处理抽提的总 RNA。

保存温度以及稳定性:

TRzol LS 在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2-8℃的环境下。氯仿替代物室温避光保存。

重要提示：

有毒物接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤。一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适，看医生并寻求苯酚和其他成分的正确治疗方案。

从少量的组织(1~ 10mg)或细胞(102-104 个)中分离RNA样品：往组织或细胞中加入 800µl TRzol。待样品裂解后，加入氯仿替代物并进行步骤 2 中的抽提操作。可在用异丙醇沉淀 RNA 之前，加入 5~ 10μg 无 RNA 酶的 glycogen 作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿替代物前用26 号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。Glycogen会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4mg/ml之前它不会抑制逆转录反应第一链的合成也不会抑制 PCR。


注意事项：

2.在匀浆化后和加入氯仿替代物之前，样品可以在-60℃或者-70℃保存至少一个月。将 RNA沉淀溶于75%的乙醇在2-8℃至少可以保存一周，在-5~-20℃下至少可保存一年。

3.用 TRzol LS抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，室温保持在15~30℃的条件下。
自备试剂：

异丙醇、75%乙醇(RNase-Free water 配制)、RNase-Free water（将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.1% (V/V)。放置过夜并高压灭菌）。

实验步骤：
1.样品预处理

a.生物液体

每0.25ml液体样品(血清，血浆，脑脊液等等)加入0.75ml TRzol LS，用加枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~ 10×106个细胞至少加入0.75ml TRzol LS。对于含有高污染物样品如全血样品，可以用灭菌水按照1：1比例稀释一倍后开始提取。TRzol LS和液体样品的终体积比总是3：1。

b.组织

用glass或强力匀浆器搅匀组织样品 ，每50~ 100mg组织或者0.25ml 组织悬液加 0.75ml的TRzol LS。一般50~ 100mg组织体积都要小于0.25ml ，如果组织样品的体积小于0.25ml ，加入灭菌水将组织样品体积调整到0.25ml以保证体积比例是3：1。

c.单层生长的细胞

直接往直径3.5 cm的培养板中加入0.3ml-0.4ml的TRzol LS溶解细胞，用加样枪吹打 帮助充分裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRzol LS 量（每10cm2加0.3-0.4ml）。不需要往裂解物里面加水，因为培养板中附着残留的培养 液已经充分稀释了TRzol LS  。

d.悬浮生长的细胞

通过离心来沉淀细胞 。在TRzol LS试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每5~ 10×106 的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加0.75ml的TRzol LS。和步骤b一样用灭菌水调节样品体积到0.25ml。在加入TRzol LS前应避免洗涤细胞，因为那样 会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。

e.病毒液处理

直接取病毒液，加入3倍体积TRzol LS试剂，充分振荡混匀。

2.分离阶段

将匀浆样品在15-30°C条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解。每0.75ml TRzol LS

加0. 1ml氯仿替代物。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2~ 15  min 。在2~8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15 min 。离心后混合物分成 三层：下层有机层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。 水样层的容量大约为所加TRzol LS  容量的70%。

2.RNA的沉淀

将水样层转移到一干净的试管中，如果希望分离DNA和蛋白，有机层和中间层同 样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。每0.75ml TRzol LS对应0.5ml 异丙醇。将混合的样品在15-30°C条件下孵育10min并在2~8°C下以不超过12,000×g的离 心力高速冷冻离心10 min 。RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后会形成一胶状片状 沉淀附着于试管壁和管底。

3.RNA的漂洗

移去上层悬液。用75%的乙醇(RNase-Free water配制)洗涤RNA沉淀一次，每0.75ml 的TRzol LS至少加1ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2~8℃下以不超过7,500×g的 离心力高速冷冻离心5 min。

4.RNA的再溶解

室温干燥RNA沉淀，不要在真空管里离心干燥RNA。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 样品其 OD260/OD280比值<1.6。用移液管分几次移取RNase-Free water 来溶解RNA，溶解后保存在-70°C。